By Natalie Osipenkov

Die Masterarbeit von Natalie Osipenkov aus dem Fachbereich der Mikrobiologie befasst sich mit der Aufklärung eines kürzlich entdeckten Phenylglycin (Phg)-Biosyntheseweges. Basierend auf den Erkenntnissen früherer Studien und Ergebnissen dieser Arbeit wurde ein neues Phg-Biosynthesemodell erstellt. Dar

über hinaus wurden unterschiedliche Ansätze zur Realisierung einer effektiven fermentativen Phg-Produktion untersucht. Die aproteinogene Aminosäure Phg, die natürlicherweise nur als Bestandteil von Streptogramin-Antibiotika wie Pristinamycin vorkommt, ist für die Feinchemikalienindustrie von hoher Bedeutung und wird unter anderem zur Herstellung halbsynthetischer Penicillin-Antibiotika verwendet. Die Möglichkeit zur fermentativen Gewinnung dieser Substanz stellt eine nachhaltige und umweltfreundlichere replacement zur herkömmlichen, chemischen Produktion dar.

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0 Lagerung bei -4°C. , 1985] Zusammensetzung CaCl2 Saccharose: in 860 ml H2Odeion. Lösen und autoklavieren. Danach Zugabe der weiteren sterilen Lösungen: 250 mM TES 140 mM K2SO4 1 M MgCl2 40 mM KH2PO4 250 mM CaCl2 Spurenelementlsg. 2 g/ml 29 Tabelle 17: Lösungen zur Aufreinigung von His-getaggten Fusionsproteinen über Nickel-NTASäulen Lösung/Puffer Lysepuffer Zusammensetzung NaH2PO4 NaCl2 Imidazol pH 8,0 NaH2PO4 NaCl2 Imidazol pH 8,0 NaH2PO4 NaCl2 Imidazol pH 8,0 Waschpuffer Elutionspuffer Tabelle 18: Trenngel-Puffer Sammelgel-Puffer Trenngel (12%) Sammelgel (6%) Probenpuffer (2x) Tris-Glycinpuffer (10x) Coomassie-Färbelösung 30 50 mM 300 mM 20 mM 50 mM 300 mM 250 mM Lösungen für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Puffer/Lösung Acrylamid-Stammlösung Entfärber Konzentration 50 mM 300 mM 10 mM Zusammensetzung Acrylamid Bisacrylamid Tris/HCl, pH auf 8,8 einstellen SDS Tris/HCl, pH auf 6,8 einstellen SDS Acrylamid Trenngel-Puffer 10 % APS TEMED H2Odeion.

Schließlich katalysiert die Hydroxyphenylglycin-Aminotransferase (HpgAT aus Pseudomonas putida) die Umwandlung von PGLX zu D-Phg, wobei L-Glutamat als Aminogruppen-Donor dient (Abbildung 9). Abbildung 9: Artifizieller Biosyntheseweg von D-Phenylglycin (D-Phg) in E. , 2006]. Die Identifizierung des nativen L-Phg-Biosyntheseweges in S. , 2011a] bietet eine neue Möglichkeit zur fermentativen Herstellung von D-Phg. Mit Hilfe eines synthetischen Biologie-Ansatzes wurde ein artifizielles D-Phg Operon (pglD-Operon), basierend auf dem L-Phg-Operon aus S.

000-verdünnter Antibiotikum-Stammlösung) in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit der Kultur auf Platte bzw. mit 100 μl einer Glycerinkultur, die das entsprechenden pYT-Konstrukt beinhaltet, angeimpft und über Nacht auf dem Schüttler bei 180 rpm und 37°C inkubiert. Als Kontrolle dient der E. coli Stamm mit dem leeren pYT1-Vektor. 2 ml der Vorkultur werden zum Animpfen von 100 ml LB-Medium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikane eingesetzt und bis zu einer OD578 von 0,3-0,5 bei 37°C auf dem Schüttler (180 rpm) angezogen.

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